Abstract:
A β-galactosidase é amplamente distribuída na natureza, podendo ser encontrada em
plantas, órgãos de animais e microrganismos. A hidrólise da lactose via enzimática
vem sendo uma alternativa para as indústrias alimentícias, visto que os açúcares
resultantes deste processo, glicose e galactose, são mais solúveis e doces, o que
proporciona melhorias nas características sensoriais de produtos lácteos e,
desenvolvimento de alimentos com baixo teor desse carboidrato, tornando-os ideais a
consumidores intolerantes a este açúcar. O aumento da demanda industrial da
β-galactosidase resulta na necessidade do estudo da agitação e da aeração, visando
obter um produto de elevada atividade. A utilização de enzimas na indústria alimentícia é muitas vezes limitada devido a sua baixa estabilidade. Uma das alternativas é o emprego de enzimas imobilizadas para reduzir os problemas causados pela utilização
de enzimas solúveis em aplicações industriais. A presente dissertação teve por
objetivo geral o estudo das condições de produção da β-galactosidase de Kluyveromyces marxianus CCT 7082 e caracterização parcial da enzima livre e imobilizada. No primeiro estudo foi avaliada a influência da agitação e da aeração na produção da enzima por fermentação submersa em fermentador Biostat B de 2 L, utilizando a técnica de planejamento experimental, através de um planejamento
experimental 22 (4 ensaios e 3 pontos centrais), onde as condições estudadas foram:
200; 350; 500 rpm e 0,5; 1,0; 1,5 vvm para a agitação e a aeração, respectivamente.
Neste estudo verificou-se que a agitação e a aeração, exerceram influência na produção da enzima, sendo a condição mais favorável 500 rpm e 1,5 vvm, respectivamente, atingindo uma produtividade de 1,2 U.mL-1.h-1, uma atividade enzimática de 17 U.mL-1 e uma concentração celular de 11 mg.mL-1. Em um segundo estudo foi realizada a imobilização da β-galactosidase empregando a técnica de
inclusão em gel de alginato de cálcio, seguida da caracterização das enzimas livre e
imobilizada, quanto ao pH e temperatura ótimos, parâmetros cinéticos e estabilidade
térmica. Para o estudo da influência do pH na atividade enzimática foram testados
valores de pH entre 4,6 e 8,6. A influência da temperatura na reação enzimática foi
determinada pela atividade de β-galactosidase nas temperaturas de 25 a 60ºC. Os
parâmetros cinéticos foram determinados utilizando como substrato o-nitrofenil-b-D-galactopiranosídeo (ONPG) e lactose. A estabilidade térmica foi estudada determinando-se a constante cinética de desnaturação térmica, o tempo de meia vida e a energia de ativação da reação de desnaturação, incubando-se a enzima
nas temperaturas de 30 a 45ºC. Os valores ótimo de pH e temperatura não foram
alterados quando a enzima foi imobilizada, obtendo como resultados pH 6,6 e 37ºC,
respectivamente, para ambas as formas enzimáticas. Os resultados dos parâmetros
cinéticos, Km e Vmax, para a enzima livre foram 15,1 mM e 18,9 U.mL-1; 93,71 mM e
43,9 U.mL-1 para os substratos ONPG e lactose, respectivamente. Para a enzima na
forma imobilizada os resultados para Km e Vmax foram 18,5 mM e 3,9 U.mL-1; 115,7 mM
e 3,7 U.mL-1, respectivamente, utilizando ONPG e lactose. Com relação à estabilidade
térmica enzimática, a equação de Arrhenius pôde ser aplicada para estabelecer uma
relação entre a constante cinética de desnaturação térmica e a temperatura. Pela
equação de Arrhenius determinou-se as energias da reação de ativação (9,4 e
2,1 Kcal.mol-1) e de ativação da reação de desnaturação (100 e 106 Kcal.mol-1),
respectivamente, para b-galactosidase livre e imobilizada.
Production of b-galactosidase from Kluyveromyces marxianus CCT 7082
in fermenter and partial characterization of the soluble and immobilized enzyme
β-galactosidase is widely distributed in nature and it can be found in plants, organs of animals and microorganisms. The enzymatic hydrolysis of lactose has been an
alternative to the food industries, because the result sugars of this process, glucose
and galactose, are more soluble and sweet, providing improvements in sensory
characteristics of dairy products, and development of products without lactose, ideal to consumers intolerant to this sugar. The increased of the industrial demand of
β-galactosidase results in the necessity to study the agitation and aeration, to obtain a
product of high activity. The use of enzymes in the food industries is sometimes limited
due to the low stability. One of the alternatives is the use of immobilized enzymes to reduce the problems caused by the use of soluble enzymes in industrial applications. The present dissertation had as main goal the study of the conditions of
β-galactosidase production from Kluyveromyces marxianus CCT 7082 and the partial
characterization of the free and immobilized enzyme. In the first study, the influence of
the agitation and the aeration was evaluated in the enzyme production by submerged
fermentation in Biostat B fermenter of 2 L, using experimental design 22 (4 assays with
three replicates at the center point); the study conditions were: 200, 350, 500 rpm and
0.5, 1.0, 1.5 vvm for agitation and aeration, respectively. In this study the agitation and
aeration, influenced in the β-galactosidase production, and the favorable condition was
500 rpm and 1.5 vvm, respectively, obtaining 1.2 U.mL-1.h-1 for productivity, 17 U.mL-1
for the enzymatic activity and a cellular concentration of 11 mg.mL-1. In a second study of β-galactosidase was immobilized employing the technique of calcium alginate gel inclusion, followed by the characterization of this enzyme, and comparison between free and immobilized enzymes, as for optimum pH and temperature, kinetic parameters and thermal stability. For the study of the influence of pH on the enzymatic activity, values of pH between 4.6 and 8.6 were tested. The influence of temperature on the enzyme reaction was determined at 25 to 60°C. The kinetic parameters were determined employing o-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside (ONPG) and lactose. The thermal stability was studied in order to determinate the deactivation rate constant, the half-life and the deactivation energy, incubating the suspension enzyme at 30 to 45°C. The optimum values for pH and temperature weren’t changed by the immobilization process, obtaining as results pH 6.6 and 37°C, respectively. The results for the Km and Vmax for soluble enzyme were 15.1 mM and 18.9 U.mL-1; 93.7 mM and 43.9 U.mL-1 for ONPG and lactose, respectively; and for immobilized enzyme the results for Km and Vmax were 18.5 mM and 3.9 U.mL-1; 115.7 mM and 3.7 U.mL-1, respectively, for ONPG
and lactose. In relation to the enzymatic thermal stability, the Arrhenius equation could be applied to establish a relation between deactivation rate constant and temperature. By the Arrhenius equation were determinated the activation energy (9.4 e
2.1 Kcal.mol-1) e deactivation energy (100 e 106 Kcal.mol-1), respectively, for the
soluble and immobilized enzyme.
