Abstract:
A purificação de proteínas consiste em um dos desafios da área de Bioprocessos. O
grau de pureza requerido para enzimas está diretamente relacionado com a aplicação
na qual estas serão empregadas. Os sistemas aquosos bifásicos (SAB) e o processo
de separação por membranas (UF) vêm sendo amplamente estudados na purificação
de diversas proteínas, por apresentarem algumas vantagens sobre os processos
cromatográficos, como facilidade de escalonamento e baixo custo. No entanto, a
purificação de lipases por SAB ainda é pouco reportada. Neste sentido, o foco deste
trabalho foi avaliar a utilização da melhor combinação do SAB formado por
polietilenoglicol (PEG) e tampão fosfato de potássio e a combinação com o processo
de separação por membrana, na purificação de lipase de Penicillium crustosum
produzida por fermentação em estado sólido. O SAB se apresentou como uma técnica
potencial para a separação e purificação da lipase obtendo-se fator de purificação 5,8
no sistema composto de 20% PEG 6000, 7,0% fosfato de potássio pH 8. A técnica do
planejamento experimental foi utilizada como uma estratégia para a maximização da
purificação, no qual foram avaliadas as concentrações de polietilenoglicol (PEG),
fosfato de potássio e NaCl em sistemas compostos por PEG 6000 fosfato de potássio
pH 8. O sistema 20% PEG 6000, 5,8% fosfato de potássio pH 8 com acréscimo de
4,8% de NaCl apresentou recuperação da atividade de hidrólise de 53,8% e o maior
fator de purificação 10,5. O sistema composto de 20% PEG 6000, 5,8% de fosfato de
potássio sem o acréscimo de NaCl foi o que apresentou maior atividade de
transesterificação e fator de purificação, 8,5 U/mg e 28,3 vezes, respectivamente.
Membranas comerciais com massa molecular de corte de 30 e 60 kDa foram testadas.
Com acréscimo de 0,09 mol/L de NaCl o fator de purificação aumentou de 0,8 para 1,4
vezes. Quando combinou-se o sistema aquoso bifásico e separação por membrana, o
fator de purificação em termos de atividade de hidrólise diminuiu, mas com relação à
de atividade de transesterificação aumentou, alcançando valores em torno de 39
vezes para os sistemas compostos de 11,6% PEG 6000, 10% fosfato de potássio e
1,2% NaCl e 38,3 para o sistema formado por 16% PEG 6000, 8% fosfato de potássio
e 4,8% NaCl.
The purification of proteins is one of the challenges in the area of Bioprocesses. The
purity degree required for enzymes is directly related to the application in which they
are employed. Aqueous two-phase systems (ATPS) and membrane separation
process have been investigated in the purification of several proteins, which present
some advantages over the chromatographic processes, such as easy scale-up and low
cost. However, the purification of lipases by ATPS has been little reported. In this
sense, the focus of this study was to evaluate the use of the best combination of the
ATPS consisting of polyethylene glycol (PEG) and potassium phosphate buffer and the
combination with membrane separation process for the lipases purification from
Penicillium crustosum produced by solid state fermentation. The ATPS is a potential
technique for the separation and purification of such lipases, resulting in a purification
factor 5.8 using the system composed of 20% PEG 6000, 7.0% potassium phosphate,
pH 8. The technique of experimental design was used as a strategy for maximizing the
purification, in which we assessed the concentrations of polyethylene glycol (PEG),
potassium phosphate and sodium chloride in systems composed of PEG 6000 at pH 8.
The system 20% PEG 6000, 5.8% potassium phosphate at pH 8, and 4.8% NaCl
showed a recovery of the activity (hydrolysis) of 53.8% and yielded the highest
purification factor 10.5, based on hydrolytic activity. The system made up of 20% PEG
6000, 5.8% potassium phosphate without the addition of NaCl showed highest activity
of transesterification and purification factor, 8.5 U/mg and 28,3, respectively.
Commercial membranes with molecular weight cutoff of 30 and 60 kDa were tested.
That addition of 0.09 mol/L NaCl to the enzymatic extract in the feed increased the
purification factor from 0.8 to 1.4. When the processes of ATPS and UF were
combined, the purification factor in terms of hydrolytic activity decreased, but increased
in terms of transesterification activity, reaching values around 39 for PF in the systems
composed of 11.6% PEG 6000 10% potassium phosphate and 38,3 in the systems
composed of 1.2% NaCl and 16% PEG 6000, 8% potassium phosphate and 4.8%
NaCl.
